Главная страница
qrcode

1 Приготовить мазок из мокроты, окрасить по Циль-Нильсену. Сложный способ окраски, дифференцирующий бактерии на


Скачать 32,64 Kb.
Название1 Приготовить мазок из мокроты, окрасить по Циль-Нильсену. Сложный способ окраски, дифференцирующий бактерии на
Дата11.12.2019
Размер32,64 Kb.
Формат файлаdocx
Имя файла1 Приготовить мазок из мокроты.docx
ТипДокументы
#81945
Каталог

1 Приготовить мазок из мокроты, окрасить по Циль-Нильсену.

Сложный способ окраски, дифференцирующий бактерии на

кислотоустойчивые и некислотоустойчивые.

1. На фиксированный мазок нанести карболовый фуксин Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в теч. 3-5 минут.

2. Снять бумагу, промыть препарат водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси 96º этилового спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин. Для обесцвечивания.

4. Промыть водой

5. Докрасить препарат водным раствором метиленового синего в теч. 3-5 мин.

6. Промыть водой. Высушить.

Микроскопия иммерсионная. Видим кислотоустойчивые бактерии окрашены в красный цвет, некислотоустойчивые в голубой цвет. Данный способ окраски применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале.

Техника постановки реакции агглютинации.

Ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в зависимости от титра составляет: 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100.

1.Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на другую- каплю сыворотки.

2. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бак.культуры и перемешивают до получения равномерной смеси.

3. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки 2-4 мин.

4. Р-я протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях.

5. Учет производят через 3-5 мин.

Приготовить мазок из агаровой культуры, окрасить по Граму, микроскопировать. Особенности окраски по Граму.

1. На фиксированный мазок наносят с помощью пипетки каплю карболово-спиртового раствора генцианового фиолетового, накрывают полоской фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снимают ее, а краситель смывают.

2. Наносят раствор Люголя на 2 мин.

3. Обесцвечивают препарат 95-% этиловым спиртом в течении 30–60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть препарат водой.

5. Проводят докрашивание препарата фуксином на 1–2 мин, промывают водой, подсушивают навоздухе.

6. Рассматривают с иммерсией и зарисовают (прил. 1). Делают вывод о принадлежности дрожжей к грам(+) и грам(–).

При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями, обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных, Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.

При каком заболевании используется метод Прайса. Техника постановки этого метода.

Ускоренная диагностика туберкулеза.

1. На нескольких предметных стеклах делают мазки из исследуемого материала.

2. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут серной кислотой и нейтрализуют.

3. Стекла опускают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат.

4. Через 7-14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют.

5. Вирулентные штаммы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутиков или кос (корд-фактор).

Расскажите последовательность определения фагочувствительность микроорганизмов.

1. Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бак.культур.

2. На каждый квадрат петлей наносят каплю бульонной культуры и распределяют по агару в пределах квадрата.

3. На каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по 1 капле испытуемого фага.

4. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий (стерильные пятна на бакт.газоне).

5. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его действия.

. Расскажите последовательность определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков. Покажите.

1. Исследуемую бак.культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри, на поверхность помещают бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков

2. Посевы инкубируют при 37* до след.дня.

3. По диаметру зон задержки роста культуры стафилококка судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам.

4. При зоне задержки роста до 10мм, культура малочувствительна, а свыше 10мм- высокочувствительная.

Определите подвижности бактерий методом «раздавленная капля». Покажите под микроскопом.

На поверхность обезжиренного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопировать препарат с объективом 40.

1 Реакция преципитации (РП) – это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).

Компоненты

1. Антиген (преципитиноген)

2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.

3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 методаРП в геле:

а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;

б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другупри положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации.

Примером РП в геле является реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони при диагностике дифтерии

Техника постановки метода иммунофлюоресценции(кратко)

Готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;

препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);

окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

. Постановка ИФА (прямого и непрямого метода “сендивич”)

1. Название пракического навыка: Постановка твердофазной ИФА реакции (сэндвич) на сыворотке крови ВИЧ инфицированного новорожденного реакции.

2. Цель навыка: Применение и анализ реакции твердофазной ИФА Определить наличие специфических поверхностного антигена (HBsAg) гепатита В в сыворотке крови больного Научится ставить и интерпретировать результат реакции.

3. Клиническая значимость практического навыка. Диагностика инфекционных заболеваний

4.Необходимый инструментарий: спектрометра с двухволновым режимом, термостат, холодильник, дозаторы одноканальные и многоканальные, наконечники, стеклянные флаконы 15 мл, фильтрованная бумага, цилиндр мерный 1000 мл, пластмассовые ванночки, чашки Петри, пленки защитные, дистиллированная вода, набор реагентов для ИФА анализа, сыворотка крови.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:



Алгоритм по шагам

Приготовить рабочий промывочный буферный солевой раствор.Достать пакет с планшетом и установить на рамку необходимое количество стрипов и выдержать в комнатной температуре 60 минут. Оставшиеся стрипы, немедленно, поместить в пакет и поместить в холодильник.

Во все лунки кроме первых трех заливаем раствор для разведения сывороток крови.

В первые 2 лунки вносим контроль(-), а в третью контроль(+)начиная с 4 лунки вносим сыворотку крови, объемом согласно инструкции, при внесении сыворотки необходимо перемешивать содержимое сыворотки с содержимым буфера интенсивным пипетированием.

Поставить планшет в термостатируемый шейкер 30 минут. Если он отсутствует, то необходимо убрать в термостат при температуре 37 градусов. А затем поставить в автоматический вошер для промывания, при отсутствии вошера то необходимо промыть 5 кратным заполнением и опорожнением лунок при помощи многоканального дозатора, остатки жидкости необходимо удалить интенсивным похлопыванием в губку.

В лунки планшета добавляем конъюгат автоматическим многоканальным дозатором (антитело меченное ферментом). И поместить в термостатируемый шейкер, при отсутствии его в термостат на 60 минут при температуре 370С

После инкубации планшет помещают в автоматический вошер. Остатки жидкости удаляем энергичным похлопыванием.

В каждую лунку добавляем по 100 мкл. ТМБ (тетрометилбензоат) и ставим планшет в термостатирующий шейкер без последующего отмытия.

Реакцию останавливаем внесением в лунки стоп-реагента.

Планшет помещаем в планшетный спектрофотометр.

Для интерпритации результата определяем величину критическую оптической плотности. Результат зафиксировать в тетрадь.

Всего


Постановка реакции торможения гемагглютинации

1. Название пракического навыка: Постановка реакции торможения гемагглютинации и читать результат реакции.

2. Цель навыка: Определить наличие специфических антител в сыворотке крови больного и наличие вируса (антигена) в исследуемом материале. Научится ставить и интерпретировать результат реакции торможения гемагглютинации.

3. Клиническая значимость практического навыка. Серологическая диагностика инфекционного заболевания.

4.Необходимый инструментарий: сыворотка больного, антигенный диагностикум, 1% суспензия эритроцитов, штатив, пипетки, физиологический раствор, эксикатор с дезинфицирующим раствором, перчатки.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:

Пошаговые дейсвия


Разведение сыворотки крови больного в пробирках на физ.растворе.


В пробирки наливают по 0.2 мл физ.раствора.

Сверху наливают 0.2 мл сыворотки. В контрольную пробирку сыворотку не наливают.

Сыворотка разводится 1:10; 1:20; 1:40; 1:80

Известный антиген – вирус добавляется по 0.2 мл во все пробирки.

60 мин. инкубируется при комнатной темпратуре.

1% суспензия эритроцитов добавляется во все пробирки.

30-60 мин инкубируется при комнатной темпратуре.

Результат реакции определяется по не образованию гемагглютинации. При этом на поверхности эритроцитов агглютинация антигенов не происходит, наблюдается только осадок эритроцитов (осадок с ровными краями) (реакция положительная) в виде пуговки, отрицательная в виде зонтика.

В контрольной пробирке образуется осадок с неровными краями (реакция отрицательная). Студенты записывают результат реакции и зарисовывают.


6.Интерпритация полученного результата.



. Постановка реакции связывания комплемента

1. Название пракического навыка: Постановка реакции торможения гемагглютинации и читать результат реакции.

2. Цель навыка: Провести реакцию связывании комплимента при сифилисе и его изучения. Научится ставить и интерпретировать результат реакции.

3. Клиническая значимость практического навыка. Предварительная диагностика инфекционного заболевания.(сифилиса)

4.Необходимый инструментарий: перчатки,штатив, пробирки, пипетки, физиологический раствор, сыворотка больного, антиген кардиолепин, комплемент, гемолитическая система(3% взвесь эритроцитов барана+гемолитическая сыворотка), водяная баня, термостат.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:

Выполняемые задачи

Выполнил (балл)

В штатив в один ряд ставим 7 сухих, чистых пробирок и номеруем

10

В 1 и 4 пробики добавляем 0,2 мл сыворотки больного, инактивированной при температуре 560С в течение 30 мин. на водяной бане и разведенной в соотношении 1:5

10

Добавляем по 0,2 мл во 2 пробирку положительную сыворотку крови, в 3 отрицательную сыворотку крови

10

Добавляем 0,2 мл титрованного кардиолипидного антигена в 1-ую, во 2-ую, в 3-ую и 5-ую пробирки


10

Добавляем изотонический раствор NaCl по 0,2 в 4 ва 5 пробирки, по 0,6 мл в 6 и 7 пробирки

10

Во все пробирки, кроме седьмой, добавляем по 0,2 мл рабочего раствора комплемента

10

Инкубируем при температуре 370С или 0-40в течение 30 мин.

10

Во все пробирки добавляем 0,4 мл гемолитической системы (1% эритроциты барана и гемолитическая сыворотка) (приготовленная в соотношении 1:1)

10

Инкубируем при температуре 370С в течение 20-30 мин

10

Берем пробирки и наблюдаем за результатами реакции. Сравнивают с контролем и записывают результаты.

Протокол записывается в тетради.

10

реакция Хеддельсона - один из методов экспресс-диагностики бруцеллеза. Достаточно проста в проведении, не занимает много времени, не требует особых условий. Может применяться с первых дней заболевания.
Для проведения анализа берется кровь из пальца исследуемого, капельки сыворотки крови помещаются на предметное стекло в количестве четырех штук. Далее в исследуемый материал капается бруцеллезный диагностикум, кроме последней капли - это контрольная, в нее добавляется физраствор. В случае появления хлопьев - реакция агглютинации на стекле считается положительной.

.Изучение подвижности бактерий. Метод раздавленной капли

1. Название пракического навыка: Метод раздавленной капли.

2. Цель навыка: Определение подвижности бактерии.

3. Клиническая значимость практического навыка. Постановка предварительного диагноза инфекционного заболевания при помощи микроскопического метода.

4.Необходимый инструментарий: световой микроскоп, чистая культура Vibrio cholerae, фильтровальная бумага, покровное стекло, предметное стёкло, петля, спиртовка, пипетки, штатив, физиологический раствор.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:




Пошаговые действия


1

Обезжирить предметное стекло над пламенью горелки или спиртом

2

На предметное стекло наноситься физиологический раствор

3

Наноситься культура бактерии и перемешивается (если бактерия выросла в жидкой среде физиологический раствор необязателен, берется капля среды)

4

Сверху покрыть покровным стеклом (чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его)

5

Рассматривают под микроскопом (х8), затем (х40), можно (х90).

6

Под микроскопом выявить подвижность бактерий

7

Этапы метода и оценка результата заноситься в тетрадь

Всего


Техника постановки реакции прямой и непрямой гемагглютинации и оценка результата.

а. Реакция непрямой пассивной гемагглютинации.

1. Название пракического навыка: Реакция непрямой гемагглютинации

2. Цель навыка: Определить наличие антител в сыворотке больного. Научится ставить и интерпретировать результат реакции непрямой гемагглютинации .

3. Клиническая значимость практического навыка. Серологическая диагностика инфекционного заболевания.

4.Необходимый инструментарий: Термостат, полистероловый планшет,спирт

96 % сыворотка больного, эритроцитарный диагностикум, физиологический буферный

раствор, вода (1 набор на троих студентов)

5. Алгоритм выполнения практического навыка:




Пошаговые действия

1

Берем планшетки стерильного полистерола. Сыворотка содержится в 30 мин при 560С в банне для инактивирования.

2

В первый ряд лунок U –образной планшетки микропипеткой капают по 0,1 мл физиологического раствора.

3

В первую лунку капают микропипеткой 0,1 мл инактивированной сыворотки больного, тщательно перемешивают ,затем с первой ямки берут 0,1 мл и капают во вторую ямку, таким образом, разбавляют содержимое ямок в соотношениях (1:2,1:4,1:8 и 1:128 и т.д.) содержимое последней лунки выливают в дезинфицируюший раствор .

4

Контроли ставятся в отдельных лунках – в первую ставят исследуемую сыворотку 0,1; нормальная сыворотка 0,1; диагностикум 0,1;

5

Сыворотку больного капают в лунку микропипететкой в соотношений с эритроцитарным диагностикумом 1:2 до 1:128 по 0,1 мл

6

В первую ямку вливают 1% не сенсебилизованную суспензию эритроцитов по 0,1 мл. Во вторую ямку 0,1 мл эритроцитарный диагностикум. В третью контроль 0,1 физ раствор.

7

Край планшетки тщательно перемещивают путем встряхивания и держат в термостате в 1,5 – 2 ч.или оставляют при комнатной температуре.

8

Результат фиксируют в тетрадь .

Всего

Реакция прямой гемагглютинации.

1. Название пракического навыка: реакция прямой гемагглютинации.

2. Цель навыка: Определить наличие вируса в аллантоисной жидкости. Научится ставить и интерпретировать результат реакции гемагглютинации .

3. Клиническая значимость практического навыка. Диагностика инфекционных заболевания

4.Необходимый инструментарий: штатив,термостат, полистероловй планшет, пипетки,вирусосодержащий материал, физиологический буферный раствор(ФБР), 1% куринные эритроциты, резиновые перчатки.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:



Пошаговые действия


1

В каждую лунку вносят по одной капле (0,025 мл) ФБР

10

2

Затем в каждую первую лунку вносят по одной капле исследуемого вируссодержащего материала (алантоисная жидкость) Затем готовят последовательные двойные разведения

10

3

Для этого после 3 -кратного пипетирования из первой лунки одну каплю переносят во вторую лунку и т.д. Из последней одну каплю удаляют в дезраствор.

10

4

В дальнейшем во все лунки вносят по одной капле 1%-ной суспензии куринных эритроцитов.

10

5

При этом обязательным является контроль на возможность спонтанной агглютинации.

10

6

Плашки осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин.

10

7

Учет результатов реакции производят через час после добавления суспензии эритроцитов, а затем оставляют при 4°С на 16—18 часов и повторно просматривают плашки.

10

8

Реакция гемагглютинации считается отрицательной - если в контрольной пробирке не наблюдается осадка (в виде пуговки).

10

9

Реакция гемагглютинации считается положительной если в пробирке образуется осадок ввиде зонтика. Это говорит о наличие вируса.

10

10

После записи в тетрадь зарисовываем рисунок.

10

Итого

100

Постановка реакции преципитации (в геле и пробирке) и дать оценку полученным результатам

1. Название пракического навыка: Провести реакцию термопреципитации по Асколи

(кольцепреципитация)

2. Цель навыка: Диагностика заболевания Сибирской язвы. Научится ставить и интерпретировать результат реакции.

3. Клиническая значимость практического навыка. Предварительная диагностика инфекционного заболевания.(Сибирской язвы)

4.Необходимый инструментарий: перчатки,штатив, пробирки, пипетки, физиологический раствор, сыворотка больного, вытяжка с кожи больного животного, преципитирующая сыворотка.

5. Алгоритм выполнения практического навыка:




Пошаговые действия

1

В первую специальную тонкую пробирку наливают преципитирующую сыворотку против антигена сибирской язвы.

2

Во вторую пробирку берут физиологический раствор.

3

Первую пробирку держат под углом 450, пипеткой пастера капают по стенке пробирки термоэкстракт полученный путем кипячения исследуемой кожи больного животного и последующего фильтрования.(аг)

4

Во вторую пробирку контроля, также пипеткой пастера капают по стенке пробирки тот же термоэкистракт.

5

Обе пробирки приводят в вертикальное положение.

6

При соответствующих условиях антигена с сывороткой и при правильном их наслоении между ними образуется кольцо преципитации.

7

Во второй пробирке кольца не образуется, полученные результаты рассматриваются и записываются в тетрадь и рисуют схему.


Всего:

1Вейля - Феликса реакция — диагностическая реакция агглютинации некоторых видов бактерий с сывороткой крови сыпнотифозных больных. В наст, время используется только как дополнительный тест для дифференциальной диагностики первичного сыпного тифа. Ставится путем смешивания сыворотки крови больных со взвесью суточной культуры палочки протея ОХ19: агглютинированные микробы образуют плотные белые хлопья, выпадающие в осадок. Положительная реакция наблюдается у 90 — 95% больных сыпным тифом, появляясь на 5—8-й день болезни в титрах 1 : 200—1 : 400 с постепенным нарастанием титра. 

Посев в жидкую среду можно производить пастеровской или градуированной пипеткой. При использовании пастеровской пипетки обожженным пинцетом следует надломить запаянный конец и слегка обжечь всю пипетку. Пробирку с исследуемой культурой помещают в левую руку, а пипетку – в правую между большим и средним пальцами, зажав ее верхнее отверстие указа­тельным пальцем.

Вынув ватную пробку из пробирки, обжигают края послед­ней. Осторожно опускают пипетку в пробирку и снимают указа­тельный палец. Затем закрывают указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынимают ее из пробирки. Ватную пробку и края пробирки, перед тем как закрыть, обжигают. Исследуемый материал переносят в жидкую среду. После по­сева пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев на плотные среды. При посеве на косой агар наносят прямой или зигзагообразный штрих. Для этого петлю с засе­ваемым материалом вводят в пробирку до скопившейся на дне конденсационной воды и осторожно, не взрыхляя агар, наносят штрих. Сплошной посев получают при размазывании посевного материала по всей поверхности косого агара.

На плотной среде в чашке Петри посев производят следую­щим образом. Питательную среду в пробирках расплавляют на кипящей водяной бане, охлаждают до 48-50°С и разливают ров­ным слоем высотой 3-5 мм в стерильные чашки. Застывшую среду подсушивают в термостате в закрытых чашках в течение 20-30 минут. Открытые чашки кладут вверх дном на полки тер­мостата, покрытые стерильной бумагой. Рядом с чашками по­мещают крышки. При подсушивании с поверхности питательной среды и внутренней поверхности чашек испаряется конденсаци­онная вода. Посев делают петлей в виде параллельных штрихов или стеклянным шпателем.
перейти в каталог файлов


связь с админом