Главная страница

Определение щелочной фосфатазы. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови кинетическим методом Принцип метода


НазваниеОпределение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови кинетическим методом Принцип метода
АнкорОпределение щелочной фосфатазы.doc
Дата20.10.2016
Размер46 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файлаOpredelenie_schelochnoy_fosfatazy.doc
ТипДокументы
#57
Каталогtopic46603054_27329484

С этим файлом связано 97 файл(ов). Среди них: sbornik_situatsionnykh_zadach_po_biokhimii-1.docx, Metodichka_po_vitaminam_MGMSU.rar, Vvedenie_v_obmen_v-v.rar и ещё 87 файл(а).
Показать все связанные файлы

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови кинетическим методом
Принцип метода: Щелочная фосфатаза (ЩФ) в сыворотке определяется путем измерения скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты – п-нитрофенилфосфата.


п-Нитрофенилфосфат ----------- п-нитрофенол + Н3РО4


Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности ЩФ в пробе и изеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.
Линейность метода: до 800 Е/л.

Норма: 35-123 Е/л (37С).

ЩФ в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при температуре хранения 2-8С в течение 2 дней.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 405 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Дистиллированная вода;

  6. Рабочий реагент (субстрат – 10 ммоль/л в буфере (рН 10,10,1)).

Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность выше 1,0 ед.опт.плотн. при длине волны 405 нм.
Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).

Добавить в кювету

Опытная проба

1. Сыворотка

25 мкл

2. Рабочий реагент

1 мл

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 405 нм ровно через 1 мин. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту, а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (о.п./мин).
Расчет

Расчет по фактору активности ЩФ проводят по формуле:


о.п./мин  1,025  1000

АЩФ (Е/л) = ----------------------------------- = о.п./мин  2187,

18,75  0,025  1,0

где о.п./мин – среднее изменение опт.плотн. в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

18,75 – коэффициент миллимолярного поглощения п-нитрофенола;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность ЩФ превышает 800 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Увеличение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при костных заболеваниях. Это связано с более интенсивным синтезом костного изофермента в остеобластах, либо с увеличением количества самих остеобластов.

Наиболее высокая активность ЩФ (выше нормы в 20 раз и более) определяется при деформирующем остите (болезнь Педжета), менее высокая – при рахите. Злокачественные заболевания кости также характеризуются поышеннми уровнями активности ЩФ. При гиперпаратиреоидизме концентрация фермента в сыворотке повышается незначительно.

Резкое увеличение активности ЩФ наблюдается при механической желтухе. В меньшей степени активность фермента повышается при гепатите и циррозе печени. Повышение активности фермента в сыворотке при заболеваниях печени и желчевыводящих путей связано с высвобождением печеночной ЩФ в кровь из поврежденных гепатоцитов, либо с задержкой экскреции изофермента с желчью при обструкции желчевыводящих протоков.

Самый термостабильный и малоподвижный при электрофорезе изофермент ЩФ принадлежит плаценте. Сходные свойства с ним имеет и ЩФ злокачественных новообразований.

перейти в каталог файлов
связь с админом