Главная страница

Определение общего билирубина. Определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови Принцип метода


НазваниеОпределение концентрации общего билирубина в сыворотке крови Принцип метода
Определение общего билирубина.doc
Дата20.10.2016
Размер28 Kb.
doc
Opredelenie_obschego_bilirubina.doc
ТипДокументы
#45

97 . : sbornik_situatsionnykh_zadach_po_biokhimii-1.docx, Metodichka_po_vitaminam_MGMSU.rar, Vvedenie_v_obmen_v-v.rar 87 .


Определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови
Принцип метода: В кислой среде в присутствии диазотированного 2,4-дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфическая смесь детергентов делает возмодным надежное и точное определение общего билирубина.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 540-560 нм прямо пропорциональна концентрации билирубина в нем.
Линейность метода: 1,7 - 513 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 1,7-21 мкмоль/л (25-37С).
Концентрация общего билирубина сохраняется стабильной, при условии непопадании солнечного света на образцы, в сыворотке/ гепаринизированной или ЭДТА-плазме в течение 1 дня при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 3 месяцев.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540-560 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 25 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА-плазма;

  5. Реагент 1 (детергент в ТРИС-буфере, рН 8,2 8 ммоль/л);

  6. Реагент 2 (соляная кислота 30 ммоль/л, 2,4-дихлорфенол 1 ммоль/л, детергент, диазониевая соль);

  7. Стандарт (раствор билирубина мкмоль/л);

  8. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Образец (например, сыворотка)

25 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

25 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

25 мкл

--

4. Реагент 1.

1 мл

1 мл

1 мл

Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин при 37С, или 10 мин при 20-25С. Измерить оптическую плотность А1 против холостой пробы при длине волны 540-560 нм.

5. Реагент 2

250 мкл

250 мкл

250 мкл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность А2 опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 540-560 нм. Вычислить А = А2 – А1 для образца и стандарта.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации общего билирубина в сыворотке крови проводят по формуле:


Аоп

С (мкмоль/л) = -----------  Сст,

Аст

где А – разность оптических плотностей А1 и А2;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л).
Если концентрация общего билирубина превышает 513 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Свободный (неконъюгированный) билирубин совершенно неполярен и почти нерастворим в воде, поэтому для транспортирования его в крови от селезенки к печени образуется комплекс с альбумином. В печени билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой, а образующийся комплекс билирубин–глюкуроновая кислота (связанный билирубин) экскретируется в желчные протоки.

Гипербилирубинемия может бить вызвана увеличенным образованием свободного билирубина в результате гемолиза (гемолитическая/ прегепатитная желтуха), повреждения паренхимы печени (паренхиматозная/ интрагепатитная желтуха) или закупорки желчных протоков (обтурационная/ постгепатитная желтуха).

Хроническая врожденная гипербилирубинемия (преобладание свободного билирубина) называется синдромом Гилберта и встречается довольно часто.

Высокие уровни билирубина наблюдаются у 60-70% новорожденных из-за усиленного послеродового разрушения эритроцитов и отставания в активности ферментов деградации билирубина.

Общепринятые методы анализа определяют либо общий, либо прямой билирубин. Прямой билирубин – это конъюгированный, растворимый в воде билирубин. Следовательно, неконъюгированный (свободный) билирубин может быть оценен как разница между общим и прямым билирубином.



связь с админом