Главная страница

Патент 1 исправленный вариант (1). Ранозаживляющее средство, обладающее иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами


Скачать 112,5 Kb.
НазваниеРанозаживляющее средство, обладающее иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами
АнкорПатент 1 исправленный вариант (1).doc
Дата05.07.2018
Размер112,5 Kb.
Формат файлаdoc
Имя файлаПатент 1 исправленный вариант (1).doc
ТипДокументы
#47992
Каталогsovetrmapo

С этим файлом связано 31 файл(ов). Среди них: Prezentatsia_Universiady.pdf, Inf_pismo_1_Zimnyaya_Shkola_2019.pdf, Aspirantura-informaciya.pdf, zkm_registratsia_na_sayte.pdf, Albom_pamyati_2.pdf, Informatsionnoe_pismo.pdf, Uslovia.pdf, inostr.yazyk.docx, Патент 2 исправленный вариант (1).docx, Info_Vseross_konf_Zdorovye_2016.doc и ещё 21 файл(а).
Показать все связанные файлы

РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ И АНТИОКСИДАНТНЫМ ЭФФЕКТАМИ



Изобретение относится к медицине (фармакологии, травматологии, хирургии), ветеринарии и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран, иммунную и антиоксидантную функции организма.

Известны репаранты, стимулирующие заживление кожных ран: метилурацил, эрбисол, бепантен, декспантенол. Однако при травмах многие из них влияют только на отдельные звенья патогенеза ( РЛС - Энциклопедия лекарств, выпуск 21, 2013). В связи с этим часто приходится использовать комплексную терапию. Однако такой подход к лечению ран и травм опасен взаимодействием препаратов вследствие полипрагмазии. Одновременно с этим, многие препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение (Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. - М.: Универсум паблишинт, 1997, - 532 с.).

Известны также регуляторные пептиды, обладающие репаративным и ранозаживляющим действием (Курцева А.А., Влияние регуляторного пептида глицил-гистидил-лизина и составляющих его аминокислот на регенерацию кожи и функцию нейтрофилов. Автореферат дисс. канд. мед. наук, Курск, 2008, С.15, С.18). Преимуществом пептидных средств является то, что они инактивируются путем протеолиза и распадаются до обычных аминокислот, которые не являются чужеродными (ксенобиотиками) для организма, а следовательно, обладают менее выраженными, по сравнению с последними, побочными эффектами (Белоусов Ю.Б., Кукес В.Г., В.К. Лепахин В.К., Петров В.И. Клиническая фармакология Национальное руководство. – М. Гэотар-Медиа, 2009, - 965 с.).

Известен такой пептидный препарат как тимоген, представляющий собой дипептид (NH2-L-Glu-L-Trp-COOH), который является иммуномодулятором, но при этом часто используется как репарант для стимуляции заживления ран, а также для лечения травм различной этиологии ( РЛС - Энциклопедия лекарств, выпуск 21, 2013). В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования тимогена для стимуляции заживления кожных ран и активации функции нейтрофилов крови (Синергичное иммунотропное и репаративное действие тимогена, даларгина и регуляторного пептида GLY-HIS-LYS при экспериментальной травме кожи / В.Ю.Чердаков, М.Ю.Смахтин, Г.М.Дубровин, И.И.Бобынцев //Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2013. -№ 1. – С.38-42.). Но к недостаткам этого препарата можно отнести то, что он может быстро инактивироваться под действием протеолитических ферментов (протеаз), уровень которых особенно высок в зоне воспаления (РЛС - Энциклопедия лекарств, выпуск 21, 2013). Протеазам достаточно разрушить только одну пептидную связь между двумя аминокислотами, что обьясняет малое время полужизни этого пептида ( РЛС - Энциклопедия лекарств, выпуск 21, 2013). Поэтому этот препарат может иметь недостаточную эффективность особенно при местном применении (ссылка …SaĭdakhmedovaZ.T., 2000; ReznikovK.M.??).

Все вышеперечисленное диктует необходимость поиска новых пептидных репаративных средств, обладающих более высокой биологической активностью.

Задача изобретения заключается в создании нового синтетического ранозаживляющего средства с более высокой биологической активностью.

Задача изобретения достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства применяют пептид, общей формулы NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH. Благодаря введению в молекулу пептида с С-конца аминокислоты D-Ala (D-аланина) усиливается ранозаживляющая активность, вероятно потому, что введение D-аминокислот повышает их устойчивость к действию протеаз (Greven H.M., De Wied D. Influence of peptides structurally related to ACTH and MSH on active avoidance in rats // Frontiers of Hormone research. 1977, v.4, p.140-152)

Предлагаемый в качестве репаранта пептид получают путем химического синтеза из отдельных аминокислот. Пептид может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. В качестве препарата сравнения был использован тимоген, имеющий формулу NH2-L-Glu-L-Trp-COOH, который является общедоступным фармацевтическим средством и производится фирмой МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО (Россия).
Выявление эффектов препарата проводили на крысах Вистар массой 180-220 грамм. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно). При этом полнослойные раны стандартного размера (1 см2) наносились на холке животных (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. – М., 1981. – 157 с.).

Пептиды вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно) - тимоген в рекомендованной терапевтической дозе - 1 мкг на 1 кг массы тела (РЛС - Энциклопедия лекарств, выпуск 21, 2013)., а аналог тимогена – пептид с общей формулой (NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH вводили в эквимолярной разовой дозе – 1,2 мкг/кг. Соответствующую навеску пептида растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. Крысам контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме в течение того же периода времени.

Для оценки репаративной регенерации кожи проводили гистологическое исследование кожных ран. Материал, взятый для исследования фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. После обезвоживания и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые затем окрашивали гематоксилин-эозином. При морфометрии на световом микроскопе Leica CME определяли процентное соотношение фибробластов и лимфоцитов в сосочковом слое кожи на 100 клеток ( Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. СПб.: Наука, 2005. 375 с.).

Для оценки иммунотропной активности определяли функцию нейтрофилов крови. Как известно нейтрофилы первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит вероятность нагноения раны, а следовательно, длительность раневого процесса (Фрейдлин И.С, Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. – СПб.: Наука, 2001. – 390 с). Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом (Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. – 1991. – №2. – С. 19-20.), определяя фагоцитарное число (ФЧ) (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) в мазках, окрашенных по Романовскому. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. (Фримель Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987. – 472 с.) Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan MC 400 (Labsystems, Финляндия) (Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека // Клин. лаб. диагност. – 2004. – №8. – С. 26-29.).

Для выявления антиоксидантных эффектов определяли активность супероксиддиссмутазы (СОД) (Костюк В.А., Потапов А.Н., Ковалева Ж.В. (1990) Вопр.мед. химии № 2.) и уровень малонового диальдегида (МДА) в крови (Mihara, M. Thiobarbituric acid value on fuch homogenate of rat as parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication and vitamin E definienes / M. Mihara, M. Uchiama // Biochem. Med. – 1980. – Vol. 23, № 3. – P. 302-311.) с использованием спектрофотометра Apel 330 PD (Япония).
Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Эффекты пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при внутрибрюшинном введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см2) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. – М., 1981. – 157 с.). Пептид с общей формулой NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.

Выявленные репаративные, иммунотропные и антиоксидантные эффекты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Влияние пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH на количество фибробластов и лимфоцитов (M±m, n=10) в сосочковом слое кожи при внутрибрюшинном введении в условиях кожных ран


№ п/п

Условия опыта

Фибробласты

Лимфоциты

1.

Контроль (NaCl)

29,3±4,2

20,7±1,5

2.

Тимоген 1мкг/кг

29,6±1,7

25,4±1,7*1

3.

NH2-glu-trp-D-ala 1,2 мкг/кг



34,7±1,5*1,2

24,6±1,6*1


Примечание: * – показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра – номера групп сравнения; .n – количество животных в группе.

Пептид NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает число фибробластов с коже, что свидетельствует о его репаративной активности. При этом он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (таблица 1).

Таблица 2
Иммунотропные и антиоксидантные эффекты (M±m, n=10) пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COОН в условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении


№ п/п

Условия опыта

Антиоксидантная функция

Иммунная функция

Супероксиддис-мутаза ус ед.

МДА Мкмоль/л

ФЧ

НСТ, ОП

1.

Контроль (NaCl)

2,32±0,22

2,26±0,41

4,53±0,63

0,22±0,015

2.

Тимоген 1мкг/кг

2,71±0,20*1

2,04±0,11

6,54±0,89*1

0,242±0,023*1

3.

NH2-glu-trp-D-ala 1,2 мкг/кг


2,93±0,17**1,2

1,98±0,19

5,7±0,94*1

0,294±0,009**1,2




Примечание: * – показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра – номера групп сравнения; .n – количество животных в группе.

Пептид NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает активность СОД и стимиулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови, что свидетельствует о его иммуностимулирующей и антиоксидантной активности. При этом он обладает более выраженными эффектами по сравнению с тимогеном (таблица 2).

Пример 2. Эффекты пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при внутрикожном (местном) введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см2) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. – М., 1981. – 157 с.). Пептид с общей формулой NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрикожно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.
Выявленные репаративные, иммунотропные и антиоксидантные эффекты представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3

Влияние пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH на количество фибробластов и лимфоцитов (M±m, n=10) в сосочковом слое кожи при внутрикожном введении в условиях кожных ран

№ п/п

Условия опыта

Фибробласты

Лимфоциты

1.

Контроль (NaCl)

36,5±4,4

8,3±2,1

2.

Тимоген 1мкг/кг

45,9±1,9*1

8,7±0,9

3.

NH2-glu-trp-D-ala 1,2 мкг/кг


53,9±1,2*1,2

5,8±0,9*1,2


Примечание: * – показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра – номера групп сравнения; .n – количество животных в группе.


При внутрикожном введении пептид NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает число фибробластов и снижает число лимфоцитов в коже, что свидетельствует о его стимулирующем действии на процессы репаративной регенерации, а следовательно и заживления кожных ран. При этом он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (таблица 3).

Таблица 4
Иммунотропные и антиоксидантные эффекты (M±m, n=10) пептида NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COОН в условиях кожных ран при внутрикожном введении


№ п/п

Условия опыта

Антиоксидантная функция

Иммунная функция

Супероксиддис-мутаза ус ед.

МДА Мкмоль/л

ФЧ

НСТ, ОП

1.

Контроль (NaCl)

2,32±0,22

2,26±0,41

4,53±0,63

0,22±0,015

2.

Тимоген 1мкг/кг

3,0±0,20**1

1,68±0,27**1

6,89±0,87*1

0,393±0,017**1

3.

NH2-glu-trp-D-ala 1,2 мкг/кг


3,15±0,17*1



2,35±0,14**1,2


5,88±0,94**1,2


0,322±0,148**1,2


Примечание: * – показывает достоверные отличия, р<0,05, а рядом стоящая цифра – номера групп сравнения; .n – количество животных в группе.
При внутрикожном введении пептид NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает активность СОД, что свидетельствует о проявлении им антиоксидантной активности. При этом он стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови, что свидетельствует о его иммуностимулирующей активности (таблица 4).
Таким образом, пептид, имеющий формулу NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH стимулирует процессы репаративной регенерации кожи, а следовательно заживления ран, и при этом он обладает иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном (местном) введении.
Формула изобретения

Применение синтетического пептида, общей формулы NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH, в качестве средства для стимуляции заживления кожных ран, функции нейтрофилов и антиоксидантной защиты организма.


Реферат

Изобретение относится к медицине (травматологии, хирургии) и ветеринарии и может быть использовано для стимуляции заживления кожных ран. Изобретение заключается в применении пептида, имеющего формулу NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH, отличающегося от тимогена NH2-L-Glu-L-Trp-COOH наличием дополнительной аминокислоты ( D-аланина) возле С-конца пептида.

Пептид вводился один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно) в эквимолярной с тимогеном разовой дозе (NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH – 1,2 мкг/кг , а тимоген – 1 мкг/кг массы). При парентеральном введении пептида в течение 10 дней с момента возникновения кожной раны у экспериментальных животных (крысы Вистар) наблюдалась стимуляция репаративной регенерации кожи (повышалось число фибробластов), а также активировалась функция нейтрофилов крови и усиливалась антиоксидантная защита организма (повышалась активность супероксиддисмутазы).

Таким образом, синтетический пептид, общей формулы NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH, может быть использован в качестве средства стимулирующего заживление кожных ран, функцию нейтрофилов и антиоксидантную защиту организма.




перейти в каталог файлов
связь с админом