Спиртовое брожение. Спиртовое брожение
 Скачать 192 Kb.
|
 С этим файлом связано 44 файл(ов). Среди них: Tsarenko_-_Neyroreanimatologia.pdf, Углеводы.doc, [MedBooks-Медкниги]Лечебная физическая культура при сахарном диа, Medknigi_Ershov_F_I__Kovalenko_A_L__Romancov_M_G__Golub_BookFi.p, Стероиды.doc и ещё 34 файл(а). Показать все связанные файлы 1 2 | |||||||||||||||||||||||||||||
| | Сбраживаемый сахар | Степень сбраживания молекул раффинозы | ||
|---|---|---|---|---|
| галактоза | глюкоза | фруктоза | ||
| | + | + | + | Полное |
| | — | + | + | На 2/3 (в остатке галактоза) |
| | — | | + | » 1/3 (в остатке мелибиоза) |
| | + | — | — | » 1/3 (в остатке сахароза) |
Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид, он исключается из последующего процесса и блокируется.
В таких условиях акцептором электронов (водорода) от НАДН становится дигидроксиацетонфосфат, превращающийся в глицерин-3фосфат, а затем в глицерин. Суммарная реакция соответствует уравнению
Глюкоза----глицерин + ацетальдегид (связанный) + СО2
Суммарное количество синтезированной АТФ при такой форме брожения равно нулю и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют в промышленности для получения глицерина.
Сходный вариант спиртового брожения наблюдается при выращивании дрожжей в щелочной среде.
Суммарная реакция выражается уравнением:
2 глюкоза + Н20 --2 глицерин + этанол + уксусная кислота + 2С02
Такой химизм процесса благоприятен для клеток, поскольку образующаяся уксусная кислота снижает рН среды, после чего вновь возобновляется нормальное спиртовое брожение.
В начальной стадии спиртового брожения дигидроксиацетон- фосфат также выполняет роль акцептора электронов до момента, пока не накопится ацетальдегид, необходимый для окисления НАДН. Этим объясняется наличие в начале брожения своеобразного периода индукции, во время которого появляется глицерин. Одновременно 3-фосфоглицериновый альдегид превращается в пировиноградную кислоту, последняя затем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но ацетальдегид не может восстанавливаться в спирт, так как НАДН использован для образования глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Поэтому при образовании в процессе брожения одной молекулы глицерина накапливается одна молекула пировиноградной кислоты или ацетальдегида, которая не превращается в этиловый спирт. Спиртовое и глицеринпировиноградное брожение тесно связаны. Вначале преобладает глицеринопировиноградное брожение, но даже в период бурного брожения наряду со спиртом обнаруживаются другие продукты.
В присутствии молекулярного кислорода дрожжи быстро переключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом пировиноградная кислота, образующаяся из глюкозы и других субстратов, окисляется через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) до С02 и Н20. Кроме того, ЦТК обеспечивает клетки рядом метаболитов, необходимых для дальнейших биосинтетических реакций. В энергетическом отношении дыхание более выгодно, чем брожение. Поэтому в аэробных условиях дрожжи растут лучше и образуют большую биомассу.
Подавление брожения -в аэробных условиях носит название эффекта Пастера. Он связан, видимо, с различием энергетического заряда клеток в аэробных и анаэробных условиях. Спиртовое брожение может происходить в условиях значительной аэрации при высоком содержании глюкозы в среде (1,5—2,0%). Подавление аэробного дыхания при высокой концентрации глюкозы (высокой скорости ее усвоения) называется эффектом Крэбтри или катаболитной репрессией. Этот эффект не наблюдается при выращивании дрожжей на средах, содержащих менее усваиваемые сахара. Катаболитная репрессия аэробного дыхания снижает получение дрожжами энергии. Она подавляет биосинтез промежуточных продуктов ЦТК и глиоксилатного цикла. В таких условиях необходимые для биосинтеза кислоты ЦТК образуются путем карбоксилирования пирувата.
Пироииноградная кислота обнаруживается, как правило, в небольших количествах. Основная ее часть идет на образование различныхвторичных продуктов. К ним относятся уксусная, молочная, янтарная, пропионовая, муравьиная и некоторые другие кислоты, ацетон, диацетил, ацетоин, 2,3-бутандиол, различные альдегиды и сложные эфиры.
При сбраживании дрожжами сахаров обычно накапливается небольшое количество D(—) -молочной кислоты. Исключением являетсяS. veronae, синтезирующий Ц+)-молочную кислоту. К продуктам брожения, образующимся из пировиноградной кислоты в небольшом количестве, относятся также лимонно- яблочная и диметилглицериновая кислота.
Кроме вторичных продуктов при спиртовом брожении образуютсяпобочные продукты — высшие спирты, известные под названием сивушных масел. Почти половину общего количества высших спиртов составляют два изоамиловых спирта: 3-метил-бутанол-(1) и 2-метилбутанол-(1). Наряду с ними в сивушном масле содержатся изобутиленовый, n-бутиловый, n-пропиловый и ароматические спирты (-фенилэтиловый, n-оксифенилэтиловый). Эти продукты синтезируются из соответствующих кетокислот, образующихся в результате метаболизма углеводов, или из аминокислот. Вторичные и побочные продукты существенно влияют на вкус и аромат готового продукта; накопление их не коррелирует с образованием этанола и сброженные растворы, содержащие одинаковое количество спирта, могут отличаться по вкусовым и ароматическим качествам.
Образование высших спиртов включает дезаминирование аминокислоты в кетокислоту, которая декарбоксилируется в альдегид; последний восстанавливается в спирт.
Однако не все высшие спирты синтезируются из аминокислот. Второй путь их образования можно рассматривать как биосинтез из продуктов метаболизма углеводов.
Полагают, что некоторые высшие спирты могут синтезироваться обоими путями (из аминокислот и углеводов), другие— только из продуктов метаболизма углеводов.
При спиртовом брожении образуются также серусодержащие вещества — сероводород и сульфиты. Последние могут быть в форме ионов бисульфита (HSO3-) или сернистой кислоты (H2SO3). Синтез этих веществ связан со способностью дрожжей восстанавливатьSO42-- -в S2- через сульфит (SO32--). Восстановление сульфатов в сульфиты зависит от свойств штамма дрожжей. На образование H2S влияет интенсивность брожения, а также присутствие ионов меди и цинка.
Из других серусодержащих веществ в незначительном количестве могут образовываться меркаптаны (этилмеркаптаны, метилмеркаптаны) — летучие вещества с неприятным запахом. Выделение СО2 при брожении способствует удалению этих веществ из среды.
ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ, ПРИМЕНЯЕМЫХ
В ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Дрожжи, используемые для получения спирта, относятся в основном к родуSaccharomyces. Систематика родаSaccharomyces неоднократно подвергалась пересмотру, номенклатура видов часто изменялась в зависимости от позиций авторов, придерживающихся тех или иных концепций в систематике дрожжей.
В последнем руководстве по дрожжам (Ы. Kreger-van-Rij, 1984) к родуSaccharomyces отнесено семь видов, размножаю- щихся ^вегетативно преимущественно в диплоидной фазе: Sacch. cerevisiae, S. kluyveri, S. exiguus, S. dairensis, S. servazzii, S. tellustris, S. unisporus. Как синонимыS, cerevisiae рассматриваютсяS. bayanus, S. carlsbergensisи ряд других промышленно важных дрожжей.
Наибольшее значение имеет S. cerevisiae. К этому виду относятся расы дрожжей, используемые в хлебопечении, спиртовом производстве, пивоварении, виноделии, производстве кваса. Поэтому приводим характеристику вида.
Saccharomyces cerevisiae Hansen. На солодовом сусле в трехсуточной культуре при 28 °С клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлиненную формы; располагаются единично или парами, иногда образуют короткие цепочки или мелкие грозди (рис.1). В зависимости от размера клеток штаммы этого вида можно - разделить на три морфологические группы.
К первой группе относятся штаммы, имеющие самые крупные клетки (3,5—10,5X5,0 — 21,0 мкм), ко второй — с наименьшими (2;5—7,0X11)0—19,0 мкм) к третьей — промежуточные (3,5 — 8,0X5,0— 11,5— 18,0 мкм). Некоторые штаммы образуют удлиненные клетки, достигающие 30 мкм и более.
Колонии у этих дрожжей пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью, с блестящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастный, изредка образуется примитивный псевдомицелий.
Аскообразование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом. Аски обычно содержат от одной до четырех спор шаровидной или эллипсоидальной формы. Сбраживает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и на '/з раффинозу. В аэробных условиях использует глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, на /з раффинозу. Способность к использованию L-сорбозы, трегалозы, мелецитозы, инулина, L-арабинозы, D-рибозы, глицерина, D-маннита, D-сорбита, -метил-D-глюкозида и молочной кислоты варьирует. Не ассимилирует целлобиозу, лактозу, мелибиозу, крахмал, ксилозу, D-арабинозу, L-рамнозу, эритрит, рибит, дульцит, салицин, янтарную и лимонную кислоты, инозит. Не использует в качестве источника азота NO3". Штаммы имеют различную способность расти на средах в отсутствие витаминов.
В странах Африки для получения алкогольных напитков используют делящиеся дрожжиSchizosaccharomyces (S.pombe и S. octosporus).
В пищевой промышленности дрожжи, не принадлежащие к сахаромицетам, играют, как правило, отрицательную роль, нарушая ход технологического процесса и вызывая порчу сырья и готовой продукции. ШтаммыS. cerevisiae подразделяют на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относится большинство винных и пивных дрожжей, к расам верхового — спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при температуре 6—10 °С и ниже (до 0°С), а верхового — обычно при 14—25 °С.
В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, формируя плотный осадок, верховые — всплывают на поверхность и образуют «шапку». Способность последних подниматься на поверхность обусловлена тем, что клетки после почкования остаются соединенными в небольшой цепочке; пузырьки углекислого газа поднимают их на поверхность. Оба свойства, однако, не абсолютны.
По поведению в бродящей среде дрожжи разделяют также на хлопьевидные ипылевидные. В основе этого разделения лежит различие в их флокуляционных свойствах (флокуляция— обратимая агрегация, или агглютинация, клеток).
Хлопьевидные дрожжи в конце брожения слипаются в комки («флокулы») и либо оседают на дно, либо поднимаются на поверхность. Пылевидные дрожжи в течение всего процесса брожения находятся во взвешенном состоянии. Флокулируют дрожжи как низового, так и верхового брожения. Клетки хлопьевидных дрожжей крупнее и тяжелее, чем пылевидных; последние особенно подвержены автолизу. Пылевидные дрожжи дают меньший прирост биомассы, но обладают более высокой бродильной активностью и полнее сбраживают сусло, образуют больше диацетила и высших спиртов. Хлопьевидные дрожжи лучше создают аромат напитков. Способность дрожжей к хлопьеобразованию не является стойким признаком, и штаммы могут ее постепенно утрачивать.
Во второй половине прошлого века кустарные бродильные производства были преобразованы в крупные, индустриальные. Одна из существенных трудностей, с которой столкнулась при этом промышленность, — развитие инфекции, наносившей особенно ощутимый урон. Применение чистых культур специально селекционированных микроорганизмов — важный этап борьбы за качество и чистоту процесса брожения.
Чистые культуры дрожжей размножают в производственных лабораториях на оптимальных для их роста средах, пересевая во все возрастающие емкости. В стадии высокой физиологической активности культуры передают в цех, где продолжают выращивать в дрожжерастительных аппаратах на обогащенных производственных субстратах и затем используют в технологическом процессе. В цехах создают условия, необходимые для жизнедеятельности дрожжей в заданном направлении и позволяющие подавить рост вредных микроорганизмов. Их развитие ингибируется рядом воздействий (введением антисептических веществ, большим засевом маточных дрожжей и др.), а также стремятся сохранить «естественную чистоту культуры».
На заводах в процессе длительного культивирования, особенно при непрерывных способах брожения, в результате спонтанного мутагенеза в дрожжевой популяции могут накапливаться мутанты, более приспособленные к условиям производства по сравнению с исходной расой.
Отбор новых рас дрожжей, как правило, проводят из ферментеров, в которых процесс брожения проходил с наиболее высокими показателями. Выделенные штаммы исследуют в лабораторных и производственных условиях. Расы, дающие наилучшие показатели брожения, становятся производственными и широко применяются в практике.
Изредка дрожжи, обладающие ценными производственными свойствами, удавалось выделять и из природных субстратов, условия развития в которых содействовали отбору нужных свойств. Так, в частности, в Средней Азии была выделена раса S. cerevisiae Ркацители-6, широко используемая для производства вина в различных эколого-географических районах Советского Союза.
Многие попытки селекционировать дрожжи бродильных рас получают при искусственном воздействии мутагенных факторов. Однако, мутанты, проявляющие ценные свойства в лабораторных условиях, часто не выдерживают конкуренции в производственных условиях и вытесняются.
В последние годы при селекции рас дрожжей для ряда отраслей промышленности (производство спирта из мелассы, хлебопечение) с успехом применяют метод гибридизации.
Методы генетической инженерии открывают новые пути для получения высокоэффективных рас дрожжей.
Антагонистические отношения у дрожжей рода Saccharomyces
В последнее время значительное внимание микробиологов уделяется изучению антагонизма у дрожжей, имеющее теоретическое и практическое значение. В Жизнедеятельность дрожжей производстве происходит в нестерильных условиях. Используемые чистые культуры дрожжей могут вытесняться присутствующими близкородственными формами. Вследствие этого селекционная работа не может быть успешной без выявления взаимоотношений между различными штаммами.
Были обнаружены три фенотипа дрожжей: Дрожжи-убийцы (киллеры, от «killer» -К), нейтральные (N) и чувствительные (sensitive – S). Дрожжи-убийцы (К) выделяют в субстрат токсины – вещества белково-углеводной природы (как правило, гликопротеиды), которые подавляют жизнедеятельность находящихся в субстрате чувствительных штаммов того же или другого вида. Штаммы нейтральных дрожжей (N) не подвергаются воздействию токсинов и, в свою очередь, не угнетают чувствительные штаммы.
Киллерная активность дрожжей имеет генетическую природу; соответствующие гены могут локализоваться как в цитоплазме, так и в хромосомах ядра. Под воздействием токсинов на чувствительные клетки нарушается проницаемость их стенок; токсин проникает сквозь цитоплазматическую мембрану, нарушая ее электрохимический потенциал и вызывая гибель клетки.
По данным Г.И.Наумова, признак «киллер» обусловлен наличием в цитоплазме клеток вирусоподобных частиц – киллерных плазмид. Он определяет конкурентноспособность дрожжей в смешанных популяциях. По мнению ряда исследователей, клетки-убийцы синтезируют экстрацеллюлярные нестаюбильные белки с различной молекулярной массой. После их проникновения в клетку чувствительного штамма происходит ингибирование синтеза нуклеиновых кислот. Одновременно наблюдается выброс некоторых аминокислот и глюкозы из клетки, что также свидетельствует об изменениях в клеточных мембранах под действием токсинов.
Штаммы дрожжей-убийц содержат двухспиральную РНК, отсутствующую у нейтральных и чувствительных штаммов. Мутанты, утратившие способность к продуцированию токсина, а также иммунитет к нему, были лишены одной из форм РНК, присутствующей у дрожжей убийц.
Было установлено существование двух типов дрожжей-убийц, которые обозначают как К1 и К2. Они различаются по генетическим и физиологическим признакам. Штаммы типа К2 ингибируют жизнедеятельность не только чувствительных и нейтральных, но и дрожжей-убийц, относящихся к типу К1. Дрожжи типа К1 убивают чувствительные штаммы типа К2. Среди дрожжей рода Saccharomyces обнаружены дрожжи-убийцы типа К3, которые действуют специфически на штаммы типов К1 и К2, обладая киллер-активностью по отношению к ним. Сами они также чувствительны к штаммам первых двух типов.
При хранении дрожжей в коллекции «киллер-фактор» может быть ими утрачен. Среди музейных культур преобладают чувствительные штаммы. Предполагают, что при длительном хранении фенотипы К и N изменяют свою природу, превращаясь в чувствительные. Возможность перехода из одного фенотипа в другой была подтверждена генетическим анализом дрожжей S.cerevisiae.
Антагонистические отношения (K,N,S- фенотипы) существуют у представителей различных родов и видов дрожжей, выделенных из разных природных источников, а также среди производственных штаммов дрожжей рода Saccharomyces, используемых в производстве пива, вина, японской водки сакэ.
По мнению микробиологов-виноделов виноделие является первичной экологической нишей дрожжей-убийц, где широко распространены дрожжи, продуцирующие киллер-токсины типа К2.
При селекции сахаромицетов необходимо учитывать возможное наличие в производственных субстратах дрожжей, обладающих киллер-фактором.
Кроме получения культуры дрожжей из коллекции, существует возможность использование сушенных и замороженных пивных дрожжей.